Science小鼠捐卵子发生中的细胞决定因子ZGLP1

　　在哺乳动物中，染色体决定了体细胞的性别，而在发育中的生殖细胞中，染色体又分别激活了捐卵子发生和精子发生过程。在小鼠的胚胎发育过程中，胚胎期E12.5天后，小鼠的生殖细胞开始在胚胎的捐卵巢或者睾丸中定植【1】。关于此发育过程普遍认同的假说是，在雌性中视黄酸（Retinoic acid, RA）诱导STRA8的表达，STRA8是捐卵原细胞获得捐卵子发生的细胞命运并进入减数分裂的前期相关因子；而在雄性中，RA则被胚胎支持细胞中的CYP26B1降解，被胚胎支持细胞包裹的前精原细胞随后进入精子发育信号过程【2,3】。哺乳动物的有性生殖依赖于男性和女性生殖细胞的分别发育，但其潜在机制尚不清楚。近日，日本京都大学Mitinori Saitou研究组在Science发表文章ZGLP1 is a deterant for the oogenic fate in mice，发现具有GATA样锌指结构的保守转录调节因子ZGLP1决定了小鼠捐卵子发生的细胞命运。关于此假说，最近有体外的研究分析发现，RA以及STRA8的表达并不足以诱导小鼠原始生殖细胞类似细胞（mouse primordial germ cell-like cells, mPGCLCs）获得捐卵子细胞命运，mPGCLCs来源于小鼠胚胎干细（mouse embryonic stem cells, mESCs）。Mitinori Saitou研究组在先前的研究中发现，在胚胎颗粒细胞中高表达的BMP【4,5】和RA协同控制mPGCLCs细胞中捐卵子发生发生以及减数分裂过程【6】。RA在原始生殖细胞发育过程中发挥的是抑制作用，其参与到胚胎多能性的转录因子网络之中，与RA在干细胞分化过程中的作用是相辅相成的。由此，这些发现驱动了一个捐卵子发生信号通路的基本信号通路框架，也提出了一个可能的系统性分析的思路。为了鉴定出参与到捐卵子命运决定过程中的转录因子，作者们利用体外的培养的mPGCLCs细胞系统通过RNA-seq技术，筛选到了响应BMP并上调的一些转录因子。考虑到其中一些基因与减数分裂起始过程相关【7】，因此作者们挑选了8个基因（Dazl, Gata2, Id1, Id3, Msx1, Msx2, Stra8, Zglp1）进行进一步地研究。这8个基因中的一个或者多个可能是BMP的效应因子，与RA一起诱导捐卵子细胞命运发生。作者们采用了从8个基因中每次挑选7个组合的方式进行过表达的诱导，发现只有在缺少Zglp1过表达的情况下，分化成捐卵母细胞类似细胞的数量大大降低（SYCP3+细胞）（图1）。因此作者们认为，Zglp1可能是在捐卵子细胞命运决定过程中发挥关键作用的因子。图1 七基因一组进行研究只有在缺少Zglp1的情况下，SYCP3+捐卵母细胞类似细胞的数量显著降低先前有研究发现，Zglp1表达在性腺中的体细胞之中而非生殖细胞之中，但是对捐卵子发生和精子发生过程都非常关键。但是通过RNA-seq和免疫染色分析，作者们发现，在胚胎时期Zglp1/ZGLP1特异性地、瞬时性地表达在雌性生殖细胞中DDX4+的细胞之中（E12.0-E14.5），但是在此时间段中Zglp1/ZGLP1没有表达在体细胞和雄性生殖细胞之中，而此阶段正是生殖细胞性别决定的关键时期【1】。而且，ZGLP1先于SRTA8一天表达。Zglp1-/-比Stra8-/-的表型更加严重，Zglp1-/-成年个体中精子过程有着严重的缺陷并且不育。总结来说，Zglp1对于激活雌性捐卵细胞发育包括减数分裂前期起始等在内的过程非常关键，而在雄性细胞性别决定过程中Zglp1并不是决定性因素，但是对于精原细胞减数分裂前期的有效完成是必须的。进一步地，作者们希望对Zglp1的功能和调控机制进行研究。作者们通过在不同的培养条件下（指RA和BMP的不同组合），发现Zglp1在BMP诱导后上调，但是单独的RA诱导则没有上调。因此，作者们认为，Zglp1是BMP信号通路的下游效应因子。在mPGCLCs中单独过表达ZGLP1会上调与捐卵子命运决定以及与进入减数分裂相关的基因，而且会以剂量依赖的方式诱导SYCP3+的细胞产生。而且，ZGLP1在缺乏RA的情况下足以参与捐卵子命运决定过程，可以分别以依赖RA或者不依赖于RA的方式激活捐卵子发生以及减数分裂相关的基因，而RA的存在会促进RAR介导的信号通路转录调节。与对照组相比，mPGCLCs过表达ZGLP1会上调489个基因，通过基因本体论分析后发现这些基因主要与捐卵细胞命运决定相关，比如捐卵子发生、减数分裂细胞周期以及piRNA代谢过程等等。而过表达ZGLP1后，也会下调294个基因，其中包括转录调节相关基因以及糖酵解过程相关基因。因此，BMP信号通路和ZGLP1在捐卵子命运决定过程中发挥着核心作用，而RA协助捐卵子发生的成熟过程，包括抑制原始生殖细胞程序。另外，作者们想要比较一下Zglp1与Stra8功能上的不同，因而分别建立了纯合敲除小鼠胚胎干细胞品系。作者们发现，Zglp1-/-胚胎干细胞可以正常分化出mPGCLCs，但是在BMP和RA的刺激下Zglp1-/- mPGCLCs不能建立减数分裂前DNA复制过程，也不能分化产生SYCP3+的捐卵母细胞类似细胞。而且，Zglp1在Stra8-/-中表达不受影响，但是Stra8/STRA8在Zglp1-/-中减少到不足一半。因此，Zglp1广泛影响捐卵细胞发生过程中的基因表达，而Stra8可能是作为Zglp1下游因子发挥作用的。通过进一步的ChIP-seq的实验，作者们发现ZGLP1激活的捐卵子发生过程中的关键基因主要是处于被表观遗传修饰的静息状态/抑制状态的位点。图2 ZGLP1参与捐卵子发生过程的工作模型

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　　参考文献

　　1. Spiller, C., Koopman, P. & Bowles,J. Sex Deteration in the Mammalian Germline.Annu Rev Genet51,265-285, doi:10.1146/annurev-genet-120215-035449 (2017).

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　　3. Baltus,A. E.et al.In germ cells of mouseembryonic ovaries, the decision to enter meiosis precedes premeiotic DNAreplication.Nat Genet38, 1430-1434,doi:10.1038/ng1919(2006).

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